ਜਾਣਕਾਰੀ

ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਲਾਂਬਡਾ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ

ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਲਾਂਬਡਾ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਜੋ ਮੈਂ ਲਾਂਬਡਾ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਬਾਰੇ ਲੱਭੇ ਹਨ, E.coli ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਸਮਰੂਪ DNA (ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ PCR ਉਤਪਾਦ ਜਾਂ ਇੱਕ ਲੀਨੀਅਰ dsDNA) ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਨ (ਇੰਜੈਕਟ) ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਢੰਗ ਵਜੋਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਰਹੇ ਹਨ। ਕੀ ਮੈਂ ਰਸਾਇਣਕ ਵਿਧੀ (CalCl2 + ਪੀ.ਈ.ਜੀ.) ਅਤੇ ਇਸ ਦੀ ਬਜਾਏ ਹੀਟ ਸ਼ੌਕ ਵਿਧੀ?


ਕਿਉਂਕਿ ਲਾਂਬਡਾ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਇੱਕ ਦੁਰਲੱਭ ਘਟਨਾ ਹੈ ਜਿਸ ਲਈ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਤੁਹਾਡੀ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਚੋਣ ਹੋਵੇਗੀ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਿਉਂਕਿ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਲਈ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 42º 'ਤੇ ਵਧ ਰਹੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤੁਸੀਂ ਸ਼ਾਇਦ ਰਸਾਇਣਕ ਵਿਧੀ ਨਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਮਸ਼ੀਨਰੀ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਰੋਕ ਦਿਓਗੇ।


ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀ ਵਿੱਚ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਜੀਨ ਸੰਪਾਦਨ ਦੀਆਂ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ

2012 ਵਿੱਚ, ਮੈਂ ਇੱਕ ਵਿਹਾਰਕ ਸੈਟਿੰਗ ਦੇ ਅੰਦਰ ਬੈਕਟੀਰੀਅਲ ਸਮੀਕਰਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ, ਜਦੋਂ ਐਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ (ਈ.ਕੋਲੀ) ਜੀਵ-ਰਸਾਇਣ ਵਿਭਾਗ, ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਆਫ਼ ਸਿਡਨੀ 1 ਵਿਖੇ, ਜੀਵ-ਜੰਤੂਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਕ ਮਨੁੱਖੀ ਟ੍ਰੋਪੋਲੈਸਟਿਨ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਟਰੋਪੋਏਲਾਸਟਿਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਈਲਾਸਟਿਨ ਦਾ ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਹੈ, ਕੁਦਰਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ (ECM) 2 ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੈ ਜੋ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਮੈਟਰੀਅਲ 3,4 ਦੇ ਨਾਲ ਬਾਇਓਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਇੱਕ ਜੀਨੋਮ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੀਵਣ ਦੇ ਅੰਦਰ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਈ.ਕੋਲੀ ਬੈਕਟੀਰੀਆ, ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਅਤੇ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲਜ਼ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਦੀ ਆਸਾਨ ਹੇਰਾਫੇਰੀ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ 5. ਸਿਸਟਮ ਬਾਇਓਲੋਜੀ, ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਬਾਇਓਲੋਜੀ ਅਤੇ ਈਵੇਲੂਸ਼ਨਰੀ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਦੇ ਏਕੀਕਰਣ ਨੇ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਟੂਲਜ਼ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲ, ਲਾਗਤ-ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਹੇਰਾਫੇਰੀ ਲਈ ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਨੂੰ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਇਆ ਹੈ। ਈ.ਕੋਲੀ ਖੋਜ ਅਤੇ ਉਦਯੋਗਿਕ ਕਾਰਜਾਂ ਵਿੱਚ 6. ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਨੂੰ ਚਲਾਉਣ ਲਈ, ਅਣੂ ਅਤੇ ਮਾਈਕਰੋਬਾਇਲ ਤਕਨੀਕਾਂ ਦਾ ਮੁਢਲਾ ਗਿਆਨ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਜੀਨ ਸੰਪਾਦਨ ਦੀਆਂ ਮੌਜੂਦਾ ਤਰੱਕੀਆਂ ਅਤੇ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਬਾਇਓਲੋਜੀ ਵਿੱਚ ਇਸਦੇ ਉਪਯੋਗਾਂ ਦਾ ਸੰਖੇਪ ਹੈ।

ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਦਾ ਨਵਾਂ ਯੁੱਗ

ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਵਿਕਸਤ ਹੋ ਰਹੀਆਂ ਜੀਨ ਤਕਨੀਕਾਂ ਵਧਦੀਆਂ ਗਲੋਬਲ ਚੁਣੌਤੀਆਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਹੈ। ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਨੇ ਪਾਬੰਦੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮਜ਼ 7 ਦੀ ਖੋਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪਿਛਲੇ 30 ਸਾਲਾਂ ਤੋਂ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਾਂਤੀ ਲਿਆ ਦਿੱਤੀ ਹੈ। ਪਾਬੰਦੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਜੀਨੋਮਿਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਾਧਨ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਅਣੂ ਦੀ ਕੈਂਚੀ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹਨ ਜੋ ਇੱਕ ਖਾਸ ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਕੱਟਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸੰਪਾਦਨ ਦੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਡੀਐਨਏ ਪਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਜਗ੍ਹਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। 1970 ਦੇ ਦਹਾਕੇ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਡੀਐਨਏ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਨੇ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਾਰਗ ਬਣਾਇਆ। ਈ.ਕੋਲੀ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਅਤੇ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉਤਪਾਦਨ (ਚਿੱਤਰ 1) ਲਈ, ਸ਼ਟਲ ਵੈਕਟਰ (ਇੱਕ ਅਣੂ ਵਾਹਨ) ਦੁਆਰਾ ਮੇਜ਼ਬਾਨ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਘੱਟ ਪੈਦਾਵਾਰ, ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਨੁਕਸਾਨਦੇਹ ਖੁਰਾਕ ਅਤੇ ਮੇਜ਼ਬਾਨ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਪਾਚਕ ਬੋਝ ਸਮੇਤ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ-ਅਧਾਰਿਤ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀਆਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੀਮਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਈ.ਕੋਲੀ ਇਸ ਦੀ ਬਜਾਏ ਜੀਨੋਮ. ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪਿਛਲੇ ਇੱਕ ਦਹਾਕੇ ਵਿੱਚ, ਜੀਨ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਤਰੱਕੀਆਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ, ਜਿਸਦੀ ਤਬਦੀਲੀ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ (ਇਨ-ਲੈਬ) ਦੇ ਨਾਲ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ vivo ਵਿੱਚ (ਜੀਵਾਂ ਵਿੱਚ) ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਤਕਨਾਲੋਜੀ, ਵਧੇਰੇ ਸਟੀਕ, ਤੇਜ਼ ਅਤੇ ਅਮਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੁਸ਼ਲ ਨਤੀਜਿਆਂ ਲਈ 8. ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਦ vivo ਵਿੱਚ ਰੀਕੰਬਾਈਨਰਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਨੂੰ ਪਾਬੰਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮਜ਼ ਜਾਂ ਡੀਐਨਏ ਲਿਗਸ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਕਲਾਸੀਕਲ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ 9 ਦਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਿੱਸਾ ਸਨ।

ਚਿੱਤਰ 1: .ਵਿਆਜ ਦੇ ਇੱਕ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਕੱਟਣ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ "ਵੈਕਟਰਾਂ" ਵਿੱਚ ਲਿਗੇਸ ਨਾਲ ਪੇਸਟ ਕਰਨ ਲਈ ਪਾਬੰਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ। 1970 ਦੇ ਦਹਾਕੇ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਪਾਇਨੀਅਰਿੰਗ ਕੰਮ ਅਜੇ ਵੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਪਹੁੰਚ ਹੈ (ਐਬਫ੍ਰੰਟੀਅਰ ਤੋਂ ਚਿੱਤਰ)।

ਪੁਨਰਗਠਨ

1998 ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਤੋਂ ਲੈ ਕੇ, ਰੀਕਮਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਜਾਂ ਰੀਕੋਂਬਿਨੋਜੇਨਿਕ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਨੇ ਜੀਵ ਦੇ ਅੰਦਰ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਦੀ ਸਿੱਧੀ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੱਤੀ ਹੈ (vivo ਵਿੱਚ) ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ 9,10 ਦੁਆਰਾ। ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਉਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੈ ਜਿਸ ਦੁਆਰਾ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਖੰਡਾਂ ਨੂੰ ਦੋ ਡੀਐਨਏ ਅਣੂਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਾਨ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਜੈਨੇਟਿਕ ਸਮੱਗਰੀ 7 ਦਾ ਨਵਾਂ ਸੰਯੋਜਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਈ.ਕੋਲੀ, ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਆਪਣੇ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵਿੱਚ ਵੱਸਣ ਵਾਲੇ ਵਾਇਰਸ (ਜਾਂ ਫੇਜ਼) ਆਪਣੇ ਖੁਦ ਦੇ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਕਾਰਜ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਹ ਦੋਵੇਂ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ। ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੌਜੀ ਨੇ ਡੀਐਨਏ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਲਈ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਜਿਹੇ ਫੇਜ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਫਾਇਦਾ ਲਿਆ ਹੈ। ਈ.ਕੋਲੀ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇੱਕ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਡੀਐਨਏ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਤੋਂ ਕਲੋਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਪਾਬੰਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਜਾਂ ਪੂਰਵ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ 11,12 ਦੇ। ਸਭ ਤੋਂ ਪ੍ਰਸਿੱਧ ਫੇਜ਼ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ (ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਜੋ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵਿੱਚ ਵੱਸਦੀਆਂ ਹਨ) ਨੂੰ RAC ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਅਤੇ ਲਾਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ RecET ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜ λ (ਲਾਂਬਡਾ) ਦੇ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਕੁਝ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ। ਈ.ਕੋਲੀ ਤਣਾਅ 13 .

ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਡੋਨਰ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਜਾਂ ਤਾਂ ਲੀਨੀਅਰ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ (dsDNA) ਜਾਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ (ssDNA ਓਲੀਗੋਸ) 13 ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਪਹੁੰਚਾਂ (ਸਿੰਗਲ-ਬੇਸ ਬਦਲਾਅ, ਛੋਟੇ ਮਿਟਾਉਣ, ਵੱਡੇ ਮਿਟਾਉਣ ਅਤੇ ਬਣਾਉਣ ਲਈ) ਵਿੱਚ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਛੋਟੇ ਸੰਮਿਲਨ) ਅਤੇ ਇੰਜੀਨੀਅਰ ਡੀ.ਐਨ.ਏ ਈ.ਕੋਲੀ 9 . ਲੋੜੀਂਦੇ ਬਦਲਾਅ ਦੇ ਨਾਲ ਲੀਨੀਅਰ ਡੋਨਰ ਡੀਐਨਏ ਸਬਸਟਰੇਟ ਨੂੰ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਕਾਰਜਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਤਣਾਅ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਸਮੇਂ ਦੀ ਇੱਕ ਮਿਆਦ ਲਈ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਕਾਲੋਨੀਆਂ 5,8 ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਸਕ੍ਰੀਨ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਫੇਜ਼-ਅਧਾਰਿਤ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਲੀਨੀਅਰ ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਫੇਜ਼ λ, ਬੈਕਟੀਰੀਅਲ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਜ਼, ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਅਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਅਲ ਆਰਟੀਫਿਸ਼ੀਅਲ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਜ਼ (BACS) ਵਰਗੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। 9. ਖੋਜਕਰਤਾ ਰਣਨੀਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਣੂ ਬਾਇਓਲੋਜੀ 8 ਵਿੱਚ ਕਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ, ਵਿਆਪਕ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲਾਂ ਦੇ ਅਧਾਰ 'ਤੇ ਲੋੜੀਂਦੇ ਨਿਰਮਾਣ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਢੁਕਵੇਂ ਪੁਨਰਗਠਨ ਮਾਰਗ ਦੀ ਯੋਜਨਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਕਲਾਸੀਕਲ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਲੀਨੀਅਰ ਡੋਨਰ ਡੀਐਨਏ ਸਬਸਟਰੇਟ ਅਤੇ ਰਿਪਲੀਕਨ (ਬੀਏਸੀ) ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਪਾਦਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਕਿਰਤ-ਸਹਿਤ ਅਤੇ ਮੁੜ-ਸੰਯੋਗ (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੁਆਰਾ ਵਧੇਰੇ ਕੁਸ਼ਲ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 2: ਵਿੱਚ BAC ਕਲੋਨ ਨੂੰ ਸੋਧਣਾ ਈ.ਕੋਲੀ. a) ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਵਿੱਚ, ਕਲਾਸੀਕਲ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਲਈ, ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਕੱਟੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਪਾਬੰਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਲਿਗੇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦੁਬਾਰਾ ਜੁੜ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, b) ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਪਹੁੰਚ ਨਾਲ ਜੁੜੀਆਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਤਕਨਾਲੋਜੀ (ਸੰਦਰਭ 12 ਤੋਂ ਚਿੱਤਰ) ਵਿੱਚ ਫੇਜ਼-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੇ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੁਆਰਾ ਦੂਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।

Lambda Red Recombineering in ਐਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ

ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲੀਨੀਅਰ ਡੀਐਨਏ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਐਂਜ਼ਾਈਮਜ਼ 7 ਦੁਆਰਾ ਪਤਨ ਦਾ ਸ਼ਿਕਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਪਿਛਲੇ ਦਹਾਕੇ ਤੋਂ, ਲਾਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਲ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਲਈ ਇੱਕ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਤਕਨੀਕ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਈ.ਕੋਲੀ 10 . ਤਿੰਨ ਫੇਜ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਲੈਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ: dsDNA ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ Gam, Exo ਅਤੇ ਬੀਟਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਨ 7,10 Gam ਦੁਆਰਾ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਰੇਖਿਕ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪਤਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ। ਈ.ਕੋਲੀ nucleases, Exo ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਫਸੇ DNA (ssDNA) ਬਣਾਉਣ ਲਈ dsDNA ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬੀਟਾ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ (ਚਿੱਤਰ 3) ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਤਿੰਨ ਲੈਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਇੱਛਤ ਰਚਨਾ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਨਾਲ ਕਿਵੇਂ ਮੁੜ ਜੁੜਦੀ ਹੈ ਇਸ ਬਾਰੇ ਸਹੀ ਵਿਧੀ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਬਹਿਸ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ 14। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, λ ਰੈੱਡ ਡੀਐਨਏ-ਅਧਾਰਿਤ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਤਰੀਕਾ ਹੈ ਜੋ ਸਿੱਧੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਕਦਮ ਵਿੱਚ ਮਲਟੀਪਲੈਕਸਿੰਗ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਸੰਪਾਦਨ) ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ ਆਟੋਮੇਟਿਡ ਜੀਨੋਮ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ (MAGE) 13 ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਪਾਦਨ ਸਾਧਨ ਵਜੋਂ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 3: ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜ λ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਸੰਖੇਪ ਜਾਣਕਾਰੀ ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। 1) ਐਕਸੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਐਕਸੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ (5' ਤੋਂ 3') ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਰੇਖਿਕ ਡੀਐਨਏ 'ਤੇ 3' ਓਵਰਹੈਂਗ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ। 2) ਬੀਟਾ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ (3' ਓਵਰਹੈਂਗਜ਼) ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ, ਐਸਐਸ-ਐਨੀਲਿੰਗ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਡੀਐਨਏ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। 3) ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਮ (ਇੱਥੇ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ) ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਈ.ਕੋਲੀ ਡੀਐਸਡੀਐਨਏ ਰੀਕੰਬਾਈਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਰੇਖਿਕ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਡੀਗਰੇਡ ਕਰਨ ਤੋਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (ਸੰਦਰਭ 5 ਤੋਂ ਚਿੱਤਰ)।

ਲਾਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਰੀਕੰਬਾਈਨਰਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ CRISPR/Cas9 ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਈ.ਕੋਲੀ

ਨਵੀਨਤਮ ਤਕਨੀਕਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਅਜਿਹੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਸਮੀਕਰਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਜੀਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਛੋਟੀ/ਮਾਮੂਲੀ ਰਹਿੰਦੀ ਹੈ ਜਿਸ ਨਾਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਅਤੇ ਸਿਸਟਮ ਬਾਇਓਲੋਜੀ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਛੋਟੇ ਜੀਨੋਮ ਸੋਧਾਂ ਲਈ ਛੋਟੇ ssDNA/dsDNA ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲਿਓਟਾਈਡ-ਵਿਚੋਲਗੀ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਵੱਡੀਆਂ ਸੋਧਾਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ (<1%) 15 ਦੇ ਨਾਲ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (ਪੀਸੀਆਰ ਇੱਕ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਤਕਨੀਕ ਐੱਮਪੀਐੱਲਬੀਓਲੋਜੀ ਵਿੱਚ) ਦੁਆਰਾ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਲੋੜੀਂਦੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਜੋ ਸਪਸ਼ਟ ਫੀਨੋਟਾਈਪਿਕ ਤਬਦੀਲੀ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਆਉਂਦੇ ਹਨ 15. ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਵਿਧੀਆਂ ਜੀਨ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਮਾਰਕਰ ਪਾਉਣ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਹੋਰ ਸੋਧਾਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਜੀਨੋਮ ਵਿੱਚ ਦਾਗ ਬਣਦੇ ਹਨ। ਕਈ ਗੇੜਾਂ ਦੇ ਸੋਧਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦਾਗ ਜੀਨੋਮ ਪੁਨਰਗਠਨ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜਿਸ ਨਾਲ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਅੱਗੇ ਵਧਾਉਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨੂੰ ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਬਾਇਓਲੋਜੀ ਕਲੱਸਟਰਡ ਰੈਗੂਲਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਟਰਸਪੇਸਡ ਸ਼ਾਰਟ ਪੈਲਿਨਡਰੋਮਿਕ ਰੀਪੀਟ (CRISPR)/Cas9 ਸਿਸਟਮ ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਟੂਲ ਨਾਲ ਲੈਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਦੂਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੇ ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ, ਪ੍ਰੋਕੈਰੀਓਟਸ, ਉੱਚ ਪੌਦਿਆਂ ਸਮੇਤ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਜੀਵਾਂ ਦੇ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਸੰਪਾਦਿਤ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਸਾਬਤ ਕੀਤੀ ਹੈ। ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ 13,15. ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ, Cas 9 ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮੇਬਲ ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਹੈ ਜੋ ਲੋੜੀਂਦੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਗੁਆਉਣ ਵਾਲੇ ਲਗਭਗ ਕਿਸੇ ਵੀ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ DNA ਸਥਾਨ 'ਤੇ ਇੱਕ ਧੁੰਦਲੇ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਬ੍ਰੇਕ (DSB) ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕਿਉਂਕਿ DSB ਘਾਤਕ ਹੈ, ਇਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸਮੁੱਚੇ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਹੋਵੇਗੀ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬਿਹਤਰ ਚੋਣ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ। /ਜੰਗੀ-ਕਿਸਮ (ਗੈਰ-ਮਿਊਟੈਂਟ ਸੈੱਲ) ਬਨਾਮ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ 13. ਕਿਉਂਕਿ CRISPR/Cas9-ਕੰਪਲਡ ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਇਸਲਈ ਚੋਣ ਲਈ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਮਾਰਕਰ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਇਹ ਜੀਨ ਬਦਲਣ ਵਾਲੇ ਮਿਊਟੈਂਟ ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ "ਦਾਗ"-ਘੱਟ 15 ਹਨ। ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪਿਛਲੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

2016 ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਸੰਯੁਕਤ CRISPR/Cas9 ਅਤੇ λ Red ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ-ਅਧਾਰਿਤ MAGE ਤਕਨਾਲੋਜੀ, ਜਿਸਨੂੰ CRMAGE 15 ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਲਈ ਆਟੋਮੇਸ਼ਨ (MAGE) ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਇੱਕ ਕਦਮ ਹੋਰ ਅੱਗੇ ਵਧੀ ਹੈ। ਇਸ ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਪ੍ਰਤੀ ਦਿਨ 15 ਦੇ ਕਈ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਦੌਰਾਂ ਲਈ, ਸਮਾਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੇ ਇੱਕ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਮਿਊਟੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਜਾਣ-ਪਛਾਣ ਨੂੰ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ। CRMAGE ਪੁਨਰਗਠਨ ਦੇ ਇੱਕ ਦੌਰ ਵਿੱਚ, ਵਿਗਿਆਨੀ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਬਿੰਦੂ ਪਰਿਵਰਤਨ ਲਈ ਲਗਭਗ 98% ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸਨ ਜੋ ਕਿ ਰਵਾਇਤੀ MAGE ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 5% ਦੀ ਪਿਛਲੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਬੇਮਿਸਾਲ ਹੈ। ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਅੱਗੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਉੱਚ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ (6% ਤੋਂ 70% ਤੱਕ) ਦੇ ਨਾਲ, ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ 15 ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਨੁਵਾਦ ਨੂੰ ਸੋਧਣਾ ਸੰਭਵ ਹੈ। ਕੋਈ ਵੀ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਤੱਤ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਜਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਨੁਵਾਦ ਨੂੰ ਸੋਧਣ ਲਈ ਪਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਤਕਨੀਕੀ ਤੌਰ 'ਤੇ, 15 ਨੂੰ ਮੁੜ ਸੰਯੋਜਿਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੀ ਆਬਾਦੀ ਤੋਂ ਪੂਰੇ CRMAGE ਸੰਪਾਦਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨੂੰ ਹਟਾ ਕੇ ਇੱਕ ਸਾਫ਼, ਅੰਤਮ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨਕ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਵੀ ਸੰਭਵ ਹੈ। ਸੰਪਾਦਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ, ਖੋਜ ਟੀਮ ਨੇ ਇੱਕ ਵੈੱਬ-ਅਧਾਰਤ ਟੂਲ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦਿੱਤੀ ਹੈ ਜੋ ਸੰਪਾਦਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। CRMAGE ਤਕਨੀਕ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਕਈ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਕੰਮਕਾਜੀ ਦਿਨ ਦੇ ਅੰਦਰ ਕਈ ਚੱਕਰ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਬਣਾਏਗੀ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਜੀਨੋਮ ਦੀ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਦੀ ਰੋਜ਼ਾਨਾ ਸਮਰੱਥਾ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਹੋਵੇਗਾ। ਈ.ਕੋਲੀ ਅਤੇ ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵੀ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁਟ, ਖੋਜ ਅਤੇ ਉਦਯੋਗਿਕ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਹੋਰ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਤਣਾਅ।

ਪੋਸਟਰ ਚਿੱਤਰ: ਤੋਂ ਸਕਰੀਨਸ਼ਾਟ - 'ਜੈਨੇਟਿਕ ਸੋਧ ਕੀ ਹੈ?' ਦ ਰਾਇਲ ਸੋਸਾਇਟੀ ਦਾ ਐਨੀਮੇਟਡ ਵੀਡੀਓ, YouTube ਰਾਹੀਂ ਉਪਲਬਧ ਹੈ।


ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ: ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਅਤੇ ਬੀਏਸੀ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਟ੍ਰੈਕਟੇਬਲ ਸਿਸਟਮ

ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜ ਲਾਂਬਡਾ (ਲਾਂਬਡਾ) ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਰੈੱਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੀ 1 ਅਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਨਕਲੀ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਸ (ਬੀਏਸੀ ਜਾਂ ਪੀਏਸੀ) ਵੈਕਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤੇ ਵੱਡੇ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਹੁਣ ਤੱਕ, ਇਸ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ BAC ਜਾਂ PAC ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਨੁਕਸਦਾਰ ਲਾਂਬਡਾ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਨੂੰ ਬੰਦਰਗਾਹ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜੋ ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਫੰਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕਿਸੇ ਵੀ E. ਕੋਲੀ ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਪੋਰੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ DH10B-ਲੈਣ ਵਾਲੇ BACs ਜਾਂ PACs ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ ਡੀਐਨਏ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨੁਕਸਦਾਰ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਵਜੋਂ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਨੂੰ ਫੇਜ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਇੱਥੇ ਇੱਕ BAC ਕਲੋਨ ਦੇ ਵੈਕਟਰ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਚੋਣਯੋਗ ਮਾਰਕਰ ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਕੇ BAC ਸੋਧ ਲਈ ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਕਿਸੇ ਵੀ ਚੋਣਯੋਗ ਮਾਰਕਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ BAC ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤੇ ਮਨੁੱਖੀ BRCA2 ਜੀਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਮਿਸਸੈਂਸ ਮਿਊਟੇਸ਼ਨ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਾਂ। ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟਸ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਬਹੁਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਮਿੰਨੀ-ਲਾਂਬਡਾ ਦੀ ਉਪਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਸਮਰੂਪ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੁਆਰਾ ਵਿਵੋ ਜੀਨੋਮ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸਧਾਰਨ ਮੋਬਾਈਲ ਸਿਸਟਮ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਜਿਸਨੂੰ ਰੀਕੰਬੀਨੀਅਰਿੰਗ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।


ਨਤੀਜੇ ਅਤੇ ਚਰਚਾ

Red recombinase ਢੰਗ ਦੀ ਸੋਧ

ਡੈਟਸੈਂਕੋ ਅਤੇ ਵੈਨਰ [20] ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਿਤ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀਆਂ ਸਾਡੀਆਂ ਪਹਿਲੀਆਂ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ਾਂ ਮੁੜ-ਸੰਯੋਗੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀਆਂ ਨੂੰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਅਸਫਲ ਰਹੀਆਂ ਸਨ। ਕਈ ਅਜ਼ਮਾਇਸ਼ਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਨੂੰ ਸੋਧਣ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ। ਸੋਧਾਂ ਨੇ ਸਾਡੇ ਤਣਾਅ ਦੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ, ਜੋ ਕਿ inducible ਸ਼ੀਗਾ ਟੌਕਸਿਨ-ਕਨਵਰਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਫੈਗੇਜ ਲੈ ਕੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।

ਸਭ ਤੋਂ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਮਜ਼ੋਰੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਫੇਜ਼ ਦੇ ਲਾਈਟਿਕ ਚੱਕਰ ਦੀ ਸਵੈ-ਚਾਲਤ ਸਰਗਰਮੀ ਸੀ। ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਪਿਛਲੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ (ਡੇਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ) ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਦੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟਸ ਤੋਂ ਫੇਜ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਦੁਆਰਾ ਸਮਰਥਤ ਹੈ। ਇਸ ਨੇ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਐਕਸਾਈਜ਼ਨ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਫੇਜ਼ ਰੀਲੀਜ਼ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ, ਜਿਸ ਨੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨ ਗਠਨ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ। ਇਸ ਅਸਫਲਤਾ ਦੇ ਦੋ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਨਾਂ ਨੂੰ ਮੰਨਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਕੱਟਣਾ ਫੇਜ਼ ਕਣਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਟੀਚਾ ਜੀਨ (stx) ਜਿੱਥੇ ਐਂਪਲੀਮਰ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਜੋੜਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਗੁਆਚ ਜਾਵੇਗਾ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਹੀ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ ਪਵੇਗੀ। ਵਿਕਲਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕੱਟਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਫੇਜ਼ ਕਣਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਲਾਈਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਛੱਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਪਰਿਵਰਤਨ ਲਈ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਘਟ ਜਾਵੇਗੀ। ਇਹ ਦੋਵੇਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਣਗੀਆਂ। ਪਹਿਲੇ ਕਾਰਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਸੀ, ਪਰ ਦੂਜੇ ਦੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ OD ਦੀ ਮੱਧਮ ਕਮੀ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।600 OD ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਲਾਈਸੋਜਨ ਦੇ ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ600 ਦੇ ਈ. ਕੋਲੀ C600 ਜਾਂ DH5α ਕਲਚਰ (ਗੈਰ-ਲਾਈਸੋਜਨ) ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।

ਲਾਈਟਿਕ ਚੱਕਰ ਦਾ ਸਵੈ-ਪ੍ਰੇਰਣਾ ਕਈ ਕਾਰਨਾਂ ਕਰਕੇ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ SOS ਜਵਾਬ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨਗੇ। ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਕੰਪੇਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਦੋਹਰੀ ਵਰਤੋਂ (ਪਹਿਲਾਂ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ pKD46 ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਲਈ ਅਤੇ ਦੂਜਾ PCR ਐਂਪਲੀਮਰ ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਲਈ) ਜੋ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਕਿਸੇ ਵੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਆਪਣੀ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮੂਲ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀਆਂ ਕਈ ਸੋਧਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਹੈ। ਹਰ ਕਦਮ ਦੇ ਇਹ ਸੋਧਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ ਵਰਣਨ ਇਸ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।

ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ stx pKD46 ਵੈਕਟਰ ਪਰਿਵਰਤਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਜੀਨ

ਅਸੀਂ ਸਾਡੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਵਿਧੀ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਕ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ pKD46 ਦੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। ਵੈਕਟਰ pBC-SK ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਵੈਕਟਰ pKD46 ਨੇ pBC-SK ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਪਰਿਵਰਤਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ। ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਕਾਲੋਨੀਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਔਸਤਨ pBC-SK ਨਾਲ 6-10 ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਸੀ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਇਸ ਤੱਥ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਕਿ pKD46 ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਮੂਲ ਰੱਖਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਿਰਫ 30°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇਸਲਈ pKD46 ਨਾਲ ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਕਾਸ ਦਰ pBC-SK ਨਾਲ ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਹੈ ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ ਵਧਦੀ ਹੈ।

ਇਹਨਾਂ ਸੰਭਾਵਿਤ ਨਤੀਜਿਆਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, pKD46 ਵੈਕਟਰ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਨੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਕੀਤਾ stx 2ਕੁਝ ਲਾਇਸੋਜਨਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ. ਇਹ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤੀਆਂ ਕਲੋਨੀਆਂ (ਟੇਬਲ 1) ਦੇ ਉੱਚ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਜਿਹੇ ਲਾਈਸੋਜਨਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ (ਟੀ-ਵਿਦਿਆਰਥੀ, ਪੀ < 0.05) ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਨਾਲੋਂ stx 2ਵੈਕਟਰ pBC-SK ਨਾਲ ਪਰਿਵਰਤਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਦਾ ਨੁਕਸਾਨ, ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਸਾਰਣੀ 1)। ਸਿਰਫ਼ ਲਾਈਸੋਜਨ C600(933W) ਅਤੇ C600(A9) ਨੇ ਕੋਈ ਜੀਨ ਦਾ ਨੁਕਸਾਨ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਜੋ C600 ਸਟ੍ਰੇਨ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਲਾਈਸੋਜਨਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਤੋਂ ਲੈ ਕੇ stx 2ਜੀਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ, ਵੈਕਟਰ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਅਤੇ stx 2ਚੁਣੇ ਗਏ ਕਲੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਸਬੰਧਤ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਡਬਲ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ stx ਅਤੇ ਰੈੱਡ ਰੀਕੋਂਬਿਨੇਜ਼ ਪੜਤਾਲਾਂ। ਸਿਰਫ਼ ਕਲੋਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ pKD46 ਅਤੇ the stx 2ਜੀਨ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ ਜੋ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਜੀਨ ਵਾਲੇ ਐਂਪਲੀਮਰ ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਲਈ ਅਗਲੇ ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।

ਦੂਜੇ ਪੜਾਅ ਦੇ ਕ੍ਰਮ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ rho ਸੁਤੰਤਰ ਟਰਮੀਨੇਟਰ, ਸੀਆਈ ਜੀਨ ਜਾਂ ਪ੍ਰ ਜੀਨ, ਜੋ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਫੇਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਕਾਲੋਨੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰ ਸਨ stx 2ਜੀਨ (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ)। ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮੇਜ਼ਬਾਨ ਸੈੱਲ ਤੋਂ ਪੂਰੇ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਨਿਕਾਸ ਹੋਇਆ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਇਸ ਕੰਮ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਇਸ ਲਈ ਅੱਗੇ ਦੀ ਜਾਂਚ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।

ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਲਈ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟੀਕਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ stx pKD46 ਨਾਲ ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਵਿੱਚ ਜੀਨ। ਸਾਰੇ ਲਾਈਸੋਜਨਾਂ ਲਈ ਸਥਿਤੀਆਂ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀਆਂ ਸਨ ਅਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਨੇ ਇਹ ਨਹੀਂ ਗੁਆਇਆ stx. ਇੱਕ ਸੰਭਾਵਿਤ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਰੈੱਡ ਰੀਕੋਂਬਿਨੇਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਕੁਝ ਲਾਈਸੋਜਨਾਂ ਦੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਜੀਨੋਮ ਤੋਂ ਕੁਝ ਪ੍ਰੋਫੈਗੇਜ ਦੇ ਕਟੌਤੀ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਬਿਨਾਂ ਵਾਇਰਸ ਦੇ ਗਠਨ ਦੇ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਦੇ ਬਿਨਾਂ।

ਐਂਪਲੀਮਰ ਦਾ ਨਿਰਮਾਣ

ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੋਧਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਵਿੱਚ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਮਰ ਦਾ ਨਿਰਮਾਣ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ। ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਸੈੱਟ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਮਾਰਕਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੈੱਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ 36 bp ਅਤੇ 40 bp ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਕ੍ਰਮ (ਛੋਟੇ ਸਮਰੂਪ ਹਥਿਆਰਾਂ) ਨੂੰ ਸਮਰੂਪਤਾ ਨਾਲ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। stx ਜੀਨ (ਸਾਰਣੀ 2)। ਇਹ ਸਾਂਝੇ ਕ੍ਰਮ ਰੈੱਡ ਰੀਕੋਂਬਿਨੇਸ ਸਿਸਟਮ ਨਾਲ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਹੋਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਸੀ। ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ Tc ਐਂਪਲੀਮਰ ਅਤੇ ਇੱਕ Cm ਐਂਪਲੀਮਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਾਡੇ ਲਾਇਸੋਜਨਾਂ ਦੇ ਕੋਈ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ-ਰੋਧਕ ਟ੍ਰਾਂਸਫਾਰਮੈਂਟਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਇਸ ਲਈ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।

ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਟੀਸੀ-ਰੋਧਕ ਟ੍ਰਾਂਸਫਾਰਮੈਂਟਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਸਿਰਫ ਕੁਝ ਮੌਕਿਆਂ 'ਤੇ ਹੀ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਟੀਸੀ ਕੈਸੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਮੌਜੂਦ ਨਹੀਂ ਸੀ stx 2ਜੀਨ, ਪਰ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਵਿੱਚ ਕਿਤੇ ਹੋਰ, ਇਸ ਤੱਥ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਕਿ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਕੈਸੇਟਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡਾਂ ਵਿੱਚ ਮੂਲ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਏ ਗਏ ਗਲਤ ਏਕੀਕਰਣ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਸ਼ਰਤੀਆ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਸਨ। ਨਾਲ ਐਂਪਲੀਮਰਾਂ ਦਾ ਪਾਚਨ ਡੀਪੀਐਨਆਈ ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਨਤੀਜੇ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ. ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਲਈ ਛੋਟੇ ਸਮਰੂਪ ਕ੍ਰਮ (36–40 bp) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗਲਤ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਘਟਨਾਵਾਂ ਜਾਂ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਦਾ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਕਾਰਨ ਕਰਕੇ, ਸਮਰੂਪੀ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਜਿੱਥੇ ਰੀਕੋਂਬਿਨੇਜ਼ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਮੰਤਵ ਲਈ, 3S-PCR ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ [29] ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਰਣਨੀਤੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਐਂਪਲੀਮਰ ਦੁਆਰਾ ਸਾਂਝੇ ਕੀਤੇ ਸਮਰੂਪ ਖੇਤਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ stx 2ਜੀਨ.

ਅਸਾਧਾਰਨ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਨੀ ਔਖੀ ਹੈ। ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ stx ਲੈਂਬਡੌਇਡ ਪ੍ਰੋਫੈਗੇਜ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੀਕੋਂਬਿਨੇਜ਼ ਜੀਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਕਿਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਗੈਰ-ਹੋਮੋਲੋਗਸ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਅਚਾਨਕ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਕ ਕੈਸੇਟ ਨੂੰ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕਰਨ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰੇਗਾ। ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਕਈ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਈ. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮਜ਼ ਨੇ ਸਮਾਨ ਕ੍ਰਮ ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਫੇਜ਼ ਮੂਲ [30] ਦੇ ਮਲਟੀਪਲ ਏਕੀਕਰਣਾਂ ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਹੈ। ਇਹ ਸਾਡੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦਾ ਵਰਣਨ ਹੋਰ ਲੇਖਕਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ [31]।

ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ stx 2ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਕ ਕੈਸੇਟ ਦੇ ਉੱਪਰ ਵੱਲ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਸਮਰੂਪ ਖੇਤਰ, ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਵੇਂ ਐਂਪਲੀਮਰ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ: 3' ਟੁਕੜਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ stx 2ਸਮਰੂਪ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਕ ਕੈਸੇਟ ਅਤੇ 5' ਕੈਸੇਟ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇਹ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ stx 2ਸਮਰੂਪਤਾ (ਚਿੱਤਰ 1)। ਕੁਝ ਐਂਪਲੀਮਰ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਇੱਕ ਵਾਲਾ tet, ਇੱਕੋ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਿੱਧੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਲਈ ਬਿੱਲੀ, ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਕੈਸੇਟ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ 3'-ਟੁਕੜਾ ਪਹਿਲੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਕੈਸੇਟ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਵਿੱਚ 5'-ਟੁਕੜੇ ਨਾਲ ਜੁੜ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਤੀਜੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸੰਪੂਰਨ ਐਂਪਲੀਮਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਦੋਵੇਂ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।

ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਸਕੀਮ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ stx ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧੀ ਜੀਨ ਦੁਆਰਾ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਜੀਨ। ਚਿੱਤਰ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਬਿੱਲੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਜੀਨ.

ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਕੈਸੇਟਾਂ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਐਂਪਲੀਮਰ ਵਿੱਚ ਲੰਬੇ ਸਮਰੂਪ ਖੇਤਰਾਂ (ਹਰੇਕ ਪਾਸੇ 280 ਬੀਪੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੇ ਨਿਸ਼ਚਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਝੂਠੇ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ (ਟੇਬਲ 2) ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਦਾ ਹੱਲ ਕੀਤਾ ਹੈ। ਉਪਰੋਕਤ ਵਰਣਿਤ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ (29) ਵਿੱਚ, ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੇ ਲੰਬੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਤਰਕਸ਼ੀਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਦੋਹਰੀ ਘਟਨਾ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਸੀ ਜੋ ਗੈਰ-ਵਿੱਚ ਲੋੜੀਂਦੇ ਐਲੇਲਿਕ ਐਕਸਚੇਂਜ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਈ. ਕੋਲੀ ਕੇ-12 ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਲੇਖਕਾਂ ਦੁਆਰਾ ਇਸਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਕਿਉਂਕਿ ਲੈਂਬਡਾ-ਰੈੱਡ ਫੰਕਸ਼ਨ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਕੁਸ਼ਲ ਹੋ ਗਏ ਸਨ ਜੋ ਦੂਰੋਂ ਸਬੰਧਤ ਹਨ। ਈ. ਕੋਲੀ. ਇਸ ਲਈ, ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੇ ਲੰਬੇ ਖੇਤਰਾਂ ਨੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ. ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਾਡੀ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਇੱਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਈ. ਕੋਲੀ K-12 ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ, ਤਣਾਅ DH5α, ਲੰਬੇ ਹਥਿਆਰਾਂ ਦੀ ਉਹੀ ਰਣਨੀਤੀ ਸਾਡੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਜਾਪਦੀ ਹੈ।

ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਐਂਪਲੀਮਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦਾ ਵੀ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਡੀਐਨਏ (ਟੇਬਲ 2) ਦੇ 0.5 μg 'ਤੇ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮੂਲ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ [20] ਵਿੱਚ 10-100 ng ਤੋਂ ਵਧੇ ਹੋਏ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਸਥਾਪਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਡੇ ਹੱਥਾਂ ਵਿੱਚ ਅਤੇ ਅਸਲ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਵਰਣਿਤ ਇੱਕ ਨਾਲੋਂ ਲੰਬੇ ਐਂਪਲੀਮਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸਨ।

ਐਂਪਲੀਮਰ ਦਾ ਪਰਿਵਰਤਨ

ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਐਂਪਿਸਿਲਿਨ ਦੇ ਨਾਲ 5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ SOB ਕਲਚਰ ਅਤੇ 10 ਐਮਐਮ ਐਲ-ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡੈਟਸੇਂਕੋ ਅਤੇ ਵੈਨਰ [20] ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੋਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਹੀਂ ਹੋਏ ਸਨ। ਲਗਾਤਾਰ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ, ਲਾਇਸੋਜੇਨਿਕ ਸੈੱਲ (pKD46 + , stx 2 + ) 10, 25 ਅਤੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ 50 ਮਿ.ਲੀ. ਦੀ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤੀ ਵਾਲੀਅਮ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਕਮਪੀਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ (ਟੇਬਲ 2) ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। 50 ਮਿ.ਲੀ. ਕਲਚਰ ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋ-ਕਮਪੀਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਸਮੱਸਿਆ ਡੈਟਸੇਂਕੋ ਅਤੇ ਵੈਨਰ ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਿਤ ਪਹੁੰਚ ਵਿੱਚ ਲਾਗੂ ਨਹੀਂ ਹੋਈ [20], ਪਰ ਸਾਡੀ ਪਹੁੰਚ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨਕ ਕਲੋਨੀਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸੀ। ਇਸ ਨੇ ਸਾਡੀ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ ਸਾਡੇ ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਕੰਪੇਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਜਾਂ ਕਲਚਰ ਮੀਡੀਆ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਫੇਜ਼ ਲਾਈਸਿਸ ਦੀ ਸਰਗਰਮੀ ਦੁਆਰਾ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਸ਼ਾਇਦ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸਲਈ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਨਿਊਨਤਮ ਸੰਖਿਆ 2.5 × 10 10 CFU/ml ਦੀ ਸੀ।

ਐਲ-ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਦੀਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਅਨੁਕੂਲ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਸਾਡੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ। ਅਸੀਂ 1 ਐਮਐਮ (ਮੂਲ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ), 10 ਐਮਐਮ ਅਤੇ ਐਲ-ਅਰਬੀਨੋਜ਼ ਦਾ 0.1 ਐਮ. ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕਲੋਨ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਖਿਆ 0.1 M ਦੇ ਅਰਬੀਨੋਜ਼ (ਟੇਬਲ 2) ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ γβ ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੀ ਸੀਮਾ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਨ।exo ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ। ਇਹ ਇੱਕ ਅਜਿਹੇ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਅਰੇਬਿਨੋਜ਼ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਜਿਸ ਨੂੰ "P ਦੇ ਸਾਰੇ-ਜਾਂ-ਕੋਈ ਨਹੀਂ ਇੰਡਕਸ਼ਨ" ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈBAD" [32].

ਐਂਪਲੀਮਰ ਦੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਐਸਓਸੀ ਮਾਧਿਅਮ ਦੇ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਵਿੱਚ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਲੇਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਮੂਲ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ) ਜਾਂ 30 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਤੋਂ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿੰਨ ਘੰਟਿਆਂ ਦੀ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਦੀ ਲੋੜ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ pKD46 ਨੂੰ ਇੱਕ ਤਾਪਮਾਨ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਵੈਕਟਰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ 30°C ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਨਕਲ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ, ਵੈਕਟਰ ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਜੇ ਵੀ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਮਰੱਥ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਰਗਰਮ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਾਪਮਾਨਾਂ (ਟੇਬਲ 2) 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਹੋਰ ਕਲੋਨੀਆਂ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, 37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਨਾਲ ਵਿਕਾਸ ਦਰ ਵਧਦੀ ਹੈ, ਵਧੇਰੇ ਸੈੱਲ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।

ਪਲੇਟਿੰਗ ਮੀਡੀਆ

Tc ਅਤੇ Cm ਵਾਲੀਆਂ LB ਅਗਰ ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਚੋਣਵੇਂ ਮੀਡੀਆ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਡੈਟਸੇਂਕੋ ਅਤੇ ਵੈਨਰ [20] ਨੇ Cm ਅਤੇ Km ਲਈ 25 μg/ml ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵ ਕੀਤਾ। ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟਸ ਦੀ ਰਿਕਵਰੀ ਲਈ 20 μg/ml Tc ਜਾਂ 20 μg/ml Cm ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, Cm ਜਾਂ Tc ਪਲੇਟਾਂ (ਟੇਬਲ 2) 'ਤੇ ਕੋਈ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੋਣਵੇਂ ਮੀਡੀਆ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ. ਇਸਲਈ, 5 μg/ml Tc ਜਾਂ 5 μg/ml Cm ਵਾਲੀਆਂ LB ਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟਸ ਦੀ ਰਿਕਵਰੀ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਵਾਰ ਪਲੇਟ ਹੋਣ 'ਤੇ, ਕਲੋਨੀਆਂ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ 24 ਘੰਟੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਲਈ ਕਾਫੀ ਸਨ। ਫਿਰ ਕਲੋਨੀਆਂ ਨੂੰ ਉੱਚ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ Tc: 20 μg/ml ਅਤੇ Cm: 20 μg/ml) ਵਾਲੀਆਂ ਨਵੀਆਂ LB ਅਗਰ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜਾਂ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਲਾਈਸੋਜਨ ਸੰਭਾਵਿਤ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਤੁਰੰਤ ਨਹੀਂ ਵਧੇ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਸ ਲਈ ਕਿਉਂਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਉੱਚ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਮ੍ਹਾਂ ਕਰਾਉਣ 'ਤੇ ਨੁਕਸਾਨ ਹੋ ਗਿਆ ਸੀ।

ਵੈਕਟਰ ਦਾ ਨੁਕਸਾਨ ਲਗਾਤਾਰ ਉਪ-ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਅਤੇ 43°C 'ਤੇ ਐਂਪਿਸਿਲਿਨ ਦੀ ਚੋਣ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਸੀ [20]। ਵੈਕਟਰ pKD46 ਲਈ ਟੇਬਲ 1 ਵਿੱਚ ਵਰਣਿਤ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਮਰ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਨੂੰ ਦੇਖ ਕੇ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।

ਸਾਰਣੀ 2 ਸਾਡੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੋਧਾਂ ਅਤੇ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਅੰਤਮ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦੋ ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਵਿੱਚ ਪਰਖੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਪਰਿਵਰਤਨਾਂ ਦਾ ਸਾਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।

ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਫੇਜ਼

tet ਅਤੇ ਬਿੱਲੀ ਵਿਚ ਜੀਨ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ stx 2ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਦੇ ਜੀਨ: ØA9, ØA312, ØA534, ØA549, ØA557, ØVTB55 ਅਤੇ 933W। ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ 251 bp ਦੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ stx 2- ਸਬਯੂਨਿਟ ਅਤੇ 264 ਬੀਪੀ ਦੇ ਸਿਰੇ ਦੀ ਅੱਪਸਟਰੀਮ stx 2-ਬੀ ਸਬ-ਯੂਨਿਟ। ਹਰੇਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਵਿੱਚ ਸਬੰਧਤ ਜੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਅਤੇ ਕ੍ਰਮ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।

ਦੀ ਸ਼ਮੂਲੀਅਤ stx 2ਛੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਲਾਇਸੋਜਨਾਂ ਦੇ ਫੇਜਾਂ ਦੇ ਮੂਲ ਲਾਈਸੋਜਨਾਂ ਨਾਲੋਂ ਥੋੜੇ ਵੱਖਰੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਸਨ। ਫਿਰ ਵੀ, ਸਾਰੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਲਾਇਸੋਜਨਾਂ ਨੇ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਜੀਨ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਪਣੀ ਲਾਈਟਿਕ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਿਆ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ [33, 34], ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੀਆਂ ਤਖ਼ਤੀਆਂ stx-ਫੇਜ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਪਰੀ ਅਗਰ ਪਰਤ 'ਤੇ ਮਾੜੇ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਜਾਂ ਗੰਧਲੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸਲਈ, ਸੰਕਰਮਿਤ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਖਾਸ ਨਾਲ ਪਲੇਕ ਬਲੌਟ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਬਿੱਲੀ ਜਾਂ tet ਪੜਤਾਲਾਂ (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ)।

ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਕੈਸੇਟ ਫੇਜ਼ ਜੀਨੋਮ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਥਿਰ ਰਹਿੰਦੀ ਪ੍ਰਤੀਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਚੋਣ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਉਪ-ਸਭਿਆਚਾਰ ਦੇ ਚਾਰ ਪੜਾਵਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਚੋਣ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਫੇਜ਼ ਜੀਨੋਮ ਵਿੱਚ ਮਾਰਕਰ ਜੀਨ ਦੀ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨਾ ਬਾਕੀ ਹੈ।

ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਗੀ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਟੈਂਟਸ

ਨਵੇਂ ਨੂੰ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਬਦਲਣ ਲਈ ਮੁੜ ਸੰਯੋਜਕ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਈ. ਕੋਲੀ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਗੀ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੇ ਤਣਾਅ, ਮੁਅੱਤਲ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਦਾ ਸੰਚਾਰ ਈ. ਕੋਲੀ DH5α ਅਤੇ ਈ. ਕੋਲੀ C600 ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਰੇ ਫੇਜ਼ਾਂ ਨੇ ਨਵੇਂ ਟਰਾਂਸਡਕਟੈਂਟਸ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ DH5α ਜਾਂ C600 'ਤੇ ਉਚਿਤ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਦਾ ਵਿਰੋਧ ਕੀਤਾ। ਪੀਸੀਆਰ ਅਤੇ ਪਲੇਕ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੁਆਰਾ ਹੋਸਟ ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਫੈਗੇਜ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।

A) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਟਰਾਂਸਡਕਟੈਂਟਸ (CFU/ml) ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਈ. ਕੋਲੀ DH5α ਅਤੇ ਈ. ਕੋਲੀ C600 ਹਰੇਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ca t ਜਾਂ tet ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧੀ ਜੀਨ. ਬੀ) ਹਰੇਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕਲੋਨੀ ਦੇ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਜੋ ਸੰਬੰਧਿਤ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਕੈਸੇਟ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ stx-ਪ੍ਰੋਫੇਜ ਲੈ ਕੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। 1: stx ਜੀਨ ਕੰਟਰੋਲ, 2: ਬਿੱਲੀ ਕੰਟਰੋਲ, 3: tet ਕੰਟਰੋਲ, 4-5: ਈ. ਕੋਲੀ DH5α ਅਤੇ ਈ. ਕੋਲੀ C600 lysogens ਦੇ ਨਾਲ stx-ਫੇਜ ::ਬਿੱਲੀ. 6–7: ਈ. ਕੋਲੀ DH5α ਅਤੇ ਈ. ਕੋਲੀ C600 lysogens ਦੇ ਨਾਲ stx-ਫੇਜ ::tet-। 8 ਨਕਾਰਾਤਮਕ PCR ਨਿਯੰਤਰਣ C) ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਵਜੋਂ, DH5α (Ø557:: ਦਾ ਕਾਲੋਨੀ ਬਲੌਟ)tet) ਲਈ ਖਾਸ ਪੜਤਾਲ ਨਾਲ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ਡ tet ਜੀਨ.

ਕੁਝ ਹੋਰ ਲੇਖਕਾਂ ਨੇ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਹੈ stxਵੱਖ-ਵੱਖ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਫੇਜ [9, 15, 16]। ਸ਼ਮਿਟ ਅਤੇ ਬਾਕੀ. [9] ਫੇਜ φ3538 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅੰਤੜੀਆਂ ਨੂੰ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਲਾਈਸੋਜਨਾਈਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਐਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ ਤਣਾਅ ਅਤੇ ਅਜਿਹੇ ਲਾਈਸੋਜਨਾਈਜ਼ਡ ਤਣਾਅ ਤੋਂ ਛੂਤ ਵਾਲੀ ਸੰਤਾਨ ਦਾ ਵਿਕਾਸ ਕਰਨਾ। ਐਲੀਸਨ ਅਤੇ ਬਾਕੀ., [15] ਨੇ ਦੋ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ Stx ਫੇਜਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਹੋਸਟ ਦੇ ਸਮਕਾਲੀ ਸੰਕਰਮਣ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਨਿਰੀਖਣ ਨੂੰ ਦਿਖਾਉਣ ਲਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਅਚੇਸਨ ਅਤੇ ਬਾਕੀ., [16] ਨੇ ਆਂਤੜੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੇ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਲਈ ਇੱਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸ਼ਿਗਾ ਟੌਕਸਿਨ 1-ਕਨਵਰਟਿੰਗ ਫੇਜ H-19B ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ। stx1-ਫੇਜ।

ਮੌਜੂਦਾ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਵਰਤਣ ਲਈ ਦੋ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧੀ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਗੀ ਫੇਜ਼ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਫੇਜ਼ਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਭੋਜਨ ਜਾਂ ਪਾਣੀ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦੇਵੇਗੀ। ਫੇਜ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨਾ ਵੀ ਦਿਲਚਸਪ ਹੋਵੇਗਾ ਅਤੇ ਭੋਜਨ ਜਾਂ ਪਾਣੀ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਜਾਂ ਉੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪ੍ਰੈਸ਼ਰ (HHP) ਦੇ ਬਾਅਦ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨਾ ਵੀ ਦਿਲਚਸਪ ਹੋਵੇਗਾ, ਜਿਸਨੂੰ ਇੱਕ ਢੰਗ ਵਜੋਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਜੋ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਕੁਝ ਦੇ lytic ਚੱਕਰ ਦੇ stx-ਫੇਜ਼ [35].

ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਫੇਜ ਵੀ ਉਪਯੋਗੀ ਸਾਧਨ ਹੋਣਗੇ stx- ਡਬਲ ਲਾਈਸੋਜਨ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਅਤੇ ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਡਬਲ ਲਾਈਸੋਜਨੀ ਅਸਲ ਵਿੱਚ STEC ਵਿੱਚ ਪਸੰਦੀਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਾਣੀ ਦੇ ਵਾਤਾਵਰਣਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੁਝ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਜਾਂ ਮਨੁੱਖਾਂ ਅਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਤਣਾਅ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ [15, 33, 36, 37]।


ਲੈਂਬਡਾ ਰੈੱਡ ਰੀਕੌਂਬੀਨੇਸ਼ਨ ਅਤੇ I-SceI ਕਲੀਵੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ Escherichia coli ਵਿੱਚ ਉੱਚ-ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਾਲੀ ਦਾਗ ਰਹਿਤ ਜੈਨੇਟਿਕ ਸੋਧ।

ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਸ ਦੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਸੋਧਾਂ ਬੁਨਿਆਦੀ ਅਤੇ ਲਾਗੂ ਖੋਜ ਦੋਵਾਂ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਨ। ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ Escherichia coli ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਦੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕੁਸ਼ਲ, ਵਰਤੋਂ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਦੋ-ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਵਿਧੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਲਾਂਬਡਾ ਰੈੱਡ (λ-ਲਾਲ) ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਅਤੇ I-SceI ਕਲੀਵੇਜ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ। λ-ਰੈੱਡ ਪੀਸੀਆਰ ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਟਿਕਾਣੇ ਦੇ ਅੰਦਰ ਜਾਂ ਨੇੜੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਮਾਰਕਰ ਜੀਨ (ਆਂ) ਅਤੇ I-SceI ਮਾਨਤਾ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਏਕੀਕਰਣ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਵਿਚਕਾਰਲਾ ਤਣਾਅ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟ ਸਟ੍ਰੇਨ ਨੂੰ I-SceI ਮਾਨਤਾ ਸਾਈਟਾਂ ਦੁਆਰਾ ਲੋੜੀਦੀ ਸੋਧ ਦੇ ਨਾਲ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਡੋਨਰ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, λ-ਰੈੱਡ ਰੀਕੌਂਬੀਨੇਸ਼ਨ ਅਤੇ I-SceI ਐਂਡੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਲਈ ਇੱਕ ਦੁਵੱਲੇ ਸਹਾਇਕ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਦੇ ਨਾਲ। ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਅਤੇ ਡੋਨਰ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਦਾ I-SceI ਕਲੀਵੇਜ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਬ੍ਰੇਕ ਅਤੇ ਡੋਨਰ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਤੋਂ ਰੇਖਿਕ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਵਿਚਕਾਰ λ-ਲਾਲ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਜੈਨੇਟਿਕ ਸੋਧਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ I-SceI ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਪਲੇਸਮੈਂਟ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਅਤੇ ਸੋਧ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ cadA ਨਾਕਆਊਟ, gdhA ਨਾਕ-ਇਨ, pepD ਦੇ ਸਹਿਜ ਮਿਟਾਉਣ, ਜ਼ਰੂਰੀ metK ਜੀਨ ਦੇ ਸਾਈਟ-ਡਾਇਰੈਕਟਡ ਮਿਊਟਾਜੇਨੇਸਿਸ, ਅਤੇ metK ਨੂੰ ਰਿਕੇਟਸੀਆ S-adenosylmethionine ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਜੀਨ ਨਾਲ ਬਦਲਣ ਲਈ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਵਿਧੀ ਜ਼ਰੂਰੀ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਜ਼ਰੂਰੀ ਜੀਨ ਸੋਧਾਂ ਨਾਲ ਵਰਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਬੁਨਿਆਦੀ ਅਤੇ ਲਾਗੂ ਜੈਨੇਟਿਕ ਖੋਜ ਨੂੰ ਲਾਭ ਪਹੁੰਚਾਏਗੀ।


ਚਰਚਾ

MAGE ਇੱਕ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਤਕਨੀਕ ਹੈ ਜਿਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇੱਕ ਆਬਾਦੀ (4) ਵਿੱਚ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੇ ਸੰਯੁਕਤ ਸੈੱਟ ਬਣਾਉਣ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੇਨ (5) ਵਿੱਚ ਸੈਂਕੜੇ ਐਲੀਲਾਂ ਨੂੰ ਸੋਧਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਵਿਆਪਕ ਜੀਨੋਮ ਸੰਪਾਦਨ ਨੂੰ ਸੁਚਾਰੂ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਵਿੱਚ ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ ਜੀਨੋਮ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਇੰਜਨੀਅਰ ਕੀਤਾ ਹੈ। Previously, we showed that converting a selectable allele in the vicinity of multiple non-selectable alleles enriches the candidate pool for highly modified clones (9). Additionally, we demonstrated that exonucleases are capable of degrading single-stranded MAGE oligos even when these oligos are protected using phosphorothioate bonds (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ., in review). Inactivating ExoI, ExoVII, ExoX, RecJ and 㮾xo significantly enhanced multiplex AR frequencies (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ., in review). This showed that intracellular MAGE oligos are a limiting factor in Redβ-mediated recombination. In the current work, we demonstrate that available ssDNA on the lagging strand of the replication fork is another limiting factor that can be increased by disrupting the interaction between DnaG primase and DnaB helicase on the replisome.

In order to increase ssDNA on the lagging strand of the replication fork, we introduced two known mutations in primase (DnaG)—K580A and Q576A. These mutations have been shown in vitro to increase OF size by interrupting the primase–helicase interaction on the replisome (13). Based on the measurements of Tougu ਅਤੇ ਬਾਕੀ. (13), we estimate that the K580A mutation increases OF length by 𢏁.5-fold and the Q576A mutation increases OF length by 𢏈-fold (Supplementary Table S2). EcNR2.dnaG.K580A and EcNR2.dnaG.Q576A exhibited significant increases in the mean number of alleles converted and decreases in the proportion of clones with zero non-selectable alleles converted. Furthermore, the strongest enhancement was observed in EcNR2. dnaG.Q576A (the variant with the longest OFs of the strains reported herein), with an intermediate enhancement observed in EcNR2.dnaG.K580A (the variant with intermediate-sized OFs). This relationship between recombination frequency and OF length further supports the model in which Redβ mediates annealing at the lagging strand of the replication fork (3,15,16,19), and our hypothesis that ssDNA on the lagging strand of the replication fork is a limiting factor during this process. With this in mind, we unsuccessfully attempted to generate a DnaG Q576A/K580A double mutant, suggesting that such an extensive manipulation of the DnaG C-terminal helicase interaction domain (24) was lethal.

Our results indicate that intracellular concentrations of MAGE oligos and the accessibility of their genomic targets are both limiting. To further increase the number of simultaneous mutations that can be generated by CoS-MAGE, it is helpful to understand whether the AR frequency is limited predominantly by the number of oligos that enter the cytoplasm, or whether kinetics are also relevant. Since a maximum of 9 ARs was observed for the 10-oligo sets compared to a maximum of just 12 ARs for the 20-oligo set, oligo uptake may be limiting. However, the fact that primase modulation—in addition to nuclease inactivation𠅎nhances AR frequency underscores the kinetic constraints regarding Redβ-mediated annealing. Each missed opportunity to anneal (i) increases the number of wt alleles in the population due to replication and (ii) decreases the number of MAGE oligos available, via dilution (cell division) and degradation (nucleases). Increasing the concentration of each reactant (i.e. intracellular oligos and accessible genomic targets) would increase the kinetics of annealing. Therefore, the number of intracellular oligos may limit the maximum number of possible mutations, but kinetics appear to be a significant force limiting the population-wide AR frequency average.

Interestingly, the nuclease-deficient Nuc5- strain (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ., in review) performed statistically similarly to the EcNR2.dnaG.Q576A strain for Sets 1 and 2, whereas EcNR2.dnaG.Q576A strongly outperformed the nuclease-deficient strain for Set 3 ( Tables 1 and ​ and2 2 see also Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ., in review). While oligo design parameters such as type of designed mutation (4), oligo length (4), oligo secondary structure (4) and off-target genomic homology (5) are major determinants of AR frequency, our results highlight the relevance of genomic context. This has previously been difficult to demonstrate, but is apparent from the discrepancy in performance of the same oligo sets tested in our Nuc5- (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ., in review), EcNR2.dnaG.Q576A, and Nuc5-.dnaG.Q576A strains. For example, different regions may have different replication fork speed or priming efficiency. These factors could locally modulate OF length, thus affecting Redβ-mediated AR frequency (although replication fork speed did not appear to be a major factor in vitro (13)). Therefore, increasing the region that must be replicated by a single OF may profoundly increase AR frequency for oligos targeting such regions. Alternatively, certain oligos may be more susceptible to nuclease degradation, so removing the responsible nucleases would disproportionately improve AR frequency for such oligos. With this in mind, we tested whether combining primase modification and nuclease removal would enhance MAGE performance more than either strategy used individually. Indeed, Nuc5-.dnaG.Q576A consistently performed the best ( Figures 3 and ​ and5) 5 ) of all tested strains. Therefore, the two disparate strategies can be combined for a larger and more robust MAGE enhancement.

To explore the extent to which OF localization impacts CoS-MAGE performance, we tested whether placing 10 oligos within a single putative OF would yield subpopulations of unmodified (few alleles converted) and ‘jackpot’ (most alleles converted) recombinants. However, CoS-MAGE using the densely clustered lacZ oligos ( Figure 4 ) produced a similar AR distribution to the ones observed for Sets 1𠄳 ( Figure 3 ), which target regions of the genome spanning several putative OFs. Since mutations within a single putative OF behaved similarly to mutations spread across many OFs, nascent OF placement does not appear to be a critical determinant of multiplex AR frequency. A number of hypotheses could explain why the expected ‘jackpots’ are not observed. Most likely, MAGE oligos are limiting due to degradation and/or lack of uptake. Thus, it is possible that most cells lack some of the oligos necessary for generating a majority of the desired mutations. Additionally, OF extension may occur too fast for all of the MAGE oligos to anneal before the OF occludes their targets. Still another explanation could be that ssDNA binding proteins occlude ssDNA on portions of the lagging strand, rendering these regions non-accessible for Redβ-mediated annealing. Finally, it is also possible that several MAGE oligos annealed within a single OF could destabilize lagging strand synthesis, leading to selection against highly modified ‘jackpot’ clones. Indeed, Corn and Berger (25) hypothesize that DnaG primase has evolved to only initiate synthesis when multiple DnaG units are bound to DnaB Helicase, as OF synthesis away from the replisome could be detrimental. Since polIIIlag dissociates from the replisome after completing an OF (26), the rapid and repeated dissociation of polIIIlag caused by multiple nearby MAGE oligos could inhibit lagging strand synthesis as the replisome proceeds beyond the target region. In the absence of the rest of the replisome, a cytosolic PolIII holoenzyme alone can synthesize 1.4 kb on a ssDNA template primed by 30 nt DNA oligos (27), but this activity is considerably diminished compared to that of an intact replisome. Therefore, if OFs are not completed when the replisome is in close proximity, this could result in persisting ssDNA that could destabilize the chromosome and/or cause lesions when the next replication fork passes through.

We also investigated whether targeting a greater number of alleles would increase the resulting number of conversions in our enhanced strains ( Figure 5 ). Although the mean number of alleles converted (mean ± std. error of the mean) increased from 2.59 ± 0.19 with 10-oligo Set 3 to 4.50 ± 0.30 (1.74-fold) with 20-oligo Sets 3 + 3X for Nuc5-.dnaG.Q576A, the mean number of alleles converted for EcNR2.dnaG.Q576A only increased from 2.54 to 2.96 (1.17-fold). The superior enhancement for the nuclease-depleted Nuc5-.dnaG.Q576A strain suggests that the intracellular oligo concentration is a limiting factor for highly multiplexed MAGE (㸐 alleles targeted). Therefore, enhancing DNA uptake and/or preservation may be a fruitful means of further improving MAGE. However, the greater multiplexibility of Nuc5-.dnaG.Q576A could also be due to the 10 new Set 3X oligos being more responsive to decreased exonuclease degradation than to increased lagging strand ssDNA availability. Additionally, there may be other limiting factors such as insufficient Redβ or unidentified host proteins. Although there is no known precedent for limiting amounts of λ Red proteins during recombination (28), our novel ability to attain 12 simultaneous non-selectable ARs ( Figure 5 A) shows that our improved strains are in uncharted territory for probing the limits of λ Red recombination.

Given that DnaG primase acts solely on the lagging strand of the replication fork, we expected that the primase modifications would only enhance lagging strand recombination. Therefore, the performance of leading-targeting CoS-MAGE in our strains was surprising, as EcNR2.dnaG.Q576A significantly outperformed EcNR2 (*ਪੀ = 0.018). Furthermore, while the total number of tolC+ recombinants was far smaller (� 2 -fold) for leading-targeting CoS-MAGE, the AR frequency of non-selectable alleles in these recombinants was still quite impressive, especially in extremely close proximity to the selectable allele. This suggests that one leading strand recombination event strongly correlates with multiple additional recombinations. Two possible explanations for the superior performance of EcNR2.dnaG.Q576A in leading-targeting CoS-MAGE are that (i) an impaired primase–helicase interaction increases accessible leading strand ssDNA or (ii) infrequent Redβ-mediated strand invasion initiates a new replication fork that travels in the opposite direction and swaps which strand is the lagging strand.

There is strong support for primase function affecting the dynamics of replication on both the lagging and leading strands (26,27,29). Lia ਅਤੇ ਬਾਕੀ. (26) observed phases in which OF synthesis is faster than helicase progression at the replication fork, alternating with phases in which helicase progression outstrips the rate of OF synthesis by PolIIIlag. These results demonstrate that DnaB-PolIIIਅਗਵਾਈ does not progress at the same instantaneous speed as PolIIIlag (26)। Furthermore, Yao ਅਤੇ ਬਾਕੀ. (29) showed that the velocity of leading-strand synthesis decreases during lagging strand synthesis, while its processivity increases. Perhaps less frequent primase–helicase binding leads to transient asynchrony of the helicase and PolIIIਅਗਵਾਈ. Given that PolIII tends to release from the replication fork more readily than does DnaB helicase (29), a transiently increased fork rate and decreased PolIIIਅਗਵਾਈ processivity could exacerbate such an asynchrony, creating a leading strand trombone loop similar to those observed during lagging strand synthesis. However, the effects of lagging strand synthesis on leading strand replication have been historically difficult to demonstrate in experiments beyond single-molecule studies (29). Given that instantaneous changes in replication dynamics appear to occur on timescales relevant to Redβ-bound oligo recombination, it is conceivable that snapshots of exposed ssDNA on the leading strand template could be recorded by measuring rates of leading-targeting AR. Single-molecule analysis of the Q576A variant could explore this hypothesis.

Alternatively, Redβ has been reported to facilitate strand invasion in vitro (30). If this also occurs vivo ਵਿੱਚ, such strand invasion would produce a D-Loop that could act as a new origin of replication (31). Therefore, invasion of one leading–targeting MAGE oligo could initiate a replication fork traveling in the opposite direction. In the reverse orientation, the leading strand would become the lagging strand so that upstream oligos would become lagging targeting and much more likely to recombine. This could lead to the highly modified clones that we observed during leading-targeting CoS-MAGE (Supplementary Figure S1). If this is the case, the non-selectable alleles would be upstream of the tolC selectable marker. Since co-selection is most effective downstream of the selectable marker (9), this may explain why co-selection enhancements decay rapidly with distance on the leading strand.

In this manuscript, we have identified available ssDNA on the lagging strand of the replication fork as a limiting factor in multiplex genome engineering. Compared with a standard recombineering strain (EcNR2), EcNR2.dnaG.Q576A displays on average 62% more alleles converted per clone, 239% more clones with 5 or more allele conversions and 38% fewer clones with 0 allele conversions in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos ( Table 2 ). We used this strategy to build on our recent advances (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., ਅਤੇ ਬਾਕੀ. in review), generating the Nuc5-.dnaG.Q576A strain, which has extended OFs and also lacks five potent exonucleases. These modifications exploited two distinct mechanisms that together increased the robustness and potency of CoS-MAGE, enabling an average of 4.50 and a maximum of 12 ARs in single cells exposed to a pool of 20 different synthetic AR oligos ( Figure 5 ). Additionally, 48% of recombinants had 5 or more ARs and only 8% had 0 modified non-selectable alleles. Furthermore, in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos, Nuc5-.dnaG.Q576A displays on average 111% more alleles converted per clone, 527% more clones with 5 or more allele conversions and 71% fewer clones with 0 allele conversions in comparison with EcNR2 ( Table 2 ). This improvement in MAGE performance will be highly valuable for increasing the diversity explored during the directed evolution of biosynthetic pathways (4) and for enabling the rapid generation of desired genotypes involving tens to hundreds of ARs (5).


High-Efficiency Scarless Genetic Modification in Escherichia coli by Using Lambda Red Recombination and I-SceI Cleavage

FIG 1 Diagram of the two-plasmid method. (A) Antibiotic cassette fragment with I-SceI recognition sites integrated at a target via λ-Red-mediated recombination, creating an intermediate strain. (B) The intermediate strain, with a mutation(s) and I-SceI recognition sites, was transformed with the donor plasmid. Expression of I-SceI was induced by l -rhamnose or IPTG. I-SceI recognition sites in the donor plasmid and the chromosome were cleaved. Integration of the donor fragment at the cleaved site of the chromosome was mediated by λ-Red recombination. FIG 2 Plasmids used for this method. (A) pREDTKI and pREDTAI (helper plasmids), with arabinose-inducible (araB promoter) λ-Red recombinase functions and IPTG-inducible (trc promoter) I-SceI expression. (B) pKSI-1 (modular plasmid for donors), based on the high-copy-number vector pBluescript II KS(−), with an MCS and two I-SceI recognition sites. (C) Part of plasmid pMDIAI (template plasmid), with the apramycin resistance gene flanked by FRT sites and I-SceI recognition sites. For pMDISI, the apramycin resistance gene was replaced with the spectinomycin resistance gene. Pink arrow, binding sites for primers MDF and MDR.
ਸੋਧHelper plasmid/promoter for I-SceI expressionDonor plasmid backboneMarker eviction rate (no. of Apr- and/or Spc-sensitive colonies/no. of tested colonies)Donor plasmid curing rate (no. of Amp- or Kan-sensitive colonies/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR (no. of colonies with expected PCR bands/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR fragment sequencing (no. of colonies with expected sequence/no. of tested colonies)
cadA ਮਿਟਾਉਣਾpREDIA/rhaBpBackZero-T4/103/43/33/3
pREDTKI/trcpMD19-T20/2018/2018/204/4
gntT integrationpREDTKI/trcpMD19-T8/107/87/74/4
pepD seamless deletionpREDKI/rhaBpKSI-13/82/32/22/2
pREDTKI/trcpKSI-16/86/66/66/6
metK ਪਰਿਵਰਤਨpREDKI/rhaBpKSI-19/305/99/94/4
pREDTKI/trcpKSI-118/1818/1816/184/4
metK ਬਦਲੀpREDTKI/trcpKSI-12/42/22/22/2

Markerless knockout and knock-in of selected genes. (i) Knockout of cadA.

(ii) Knock-in of gdhA.

(iii) Multiple modifications.

Seamless deletion of pepD.

FIG 3 Seamless pepD deletion and PCR analysis. (A) Construct with 40-bp short arms homologous to the pepD ORF and a 600-bp pepD segment replaced by a marker. (B) Construct with arms with upstream (U) and downstream (D) homology to pepD, with truncated 1.0-kb pepD segments and the apramycin (apr) resistance gene seamlessly deleted, from ATG to TAA. (C) PCR analysis of pepD ਸਮੀਕਰਨ Band sizes: BL21(DE3) (wild-type pepD), 2.5 kb intermediate strain (pepD::apr), 3.2 kb final strain (ΔpepD), 0.9 kb.

Modifications in the essential metK ਜੀਨ.

FIG 4 Modifications to metK gene and PCR analysis. (A) Construct with IsceI-apr-IsceI cassette inserted into yqgC and IsceI-spc-IsceI cassette inserted into galP. yqgC ਅਤੇ galP are nonessential genes next to metK. (B) Wild-type (WT) metK and resistance genes were replaced by mutated metK or the SAM transporter gene. ਦ galP fragment and speA-yqgB-yqgC fragment were homologous arms. (C) PCR analysis of metK. Band sizes: MG1655 (wild-type metK), 2.8 kb intermediate strain A10 (yqgC::apr galP::spc), 5.9 kb final strain with mutated metK, 2.8 kb (the same length as wild-type metK) final strain with metK replaced by SAM transporter gene, 2.6 kb.

Recombineering with overlapping single-stranded DNA oligonucleotides: testing a recombination intermediate

A phage lambda-based recombination system, Red, can be used for high-efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal or episomal DNA in vivo in Escherichia coli. When long linear double-stranded DNA with short flanking homologies to their targets are used for the recombination, the lambda Exo, Beta, and Gam proteins are required. The current model is: (i) Gam inhibits the host RecBCD activity, thereby protecting the DNA substrate for recombination (ii) Exo degrades from each DNA end in a 5' --> 3' direction, creating double-stranded DNA with 3' single-stranded DNA tails and (iii) Beta binds these 3' overhangs to protect and anneal them to complementary sequences. We have tested this model for Red recombination by using electroporation to introduce overlapping, complementary oligonucleotides that when annealed in vivo approximate the recombination intermediate that Exo should create. Using this technique we found Exo-independent recombination. Surprisingly, a similarly constructed substrate with 5' overhangs recombined more efficiently. This 5' overhang recombination required both Exo and Beta for high levels of recombination and the two oligonucleotides need to overlap by only 6 bp on their 3' ends. Results indicate that Exo may load Beta onto the 3' overhang it produces. In addition, multiple overlapping oligonucleotides were successfully used to generate recombinants in vivo, a technique that could prove useful for many genetic engineering procedures.

ਅੰਕੜੇ

Model for Red-mediated recombination. λ…

Model for Red-mediated recombination. λ Exo enters a dsDNA end and degrades one…

Model to explain the high…

Model to explain the high recombination frequency of dsDNA with 5′ overhangs. ਦ…


ਜਾਣ-ਪਛਾਣ

Essential bacterial genes are an especially interesting target for DMS because they play an important role in bacterial evolution (Long ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2015 Maddamsetti ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 ), the emergence of antibiotic resistance (Walsh, 2000 Allen ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2010 ), and strain engineering (Winkler ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2016 de Jong ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। It is important to modify the essential genes in their native genomic context. Expressing essential genes on plasmids alters the cellular fitness because of different expression levels due to copy number effects (Gibson ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013 ) and the loss of epigenetic regulation. Current genome mutagenesis techniques suffer from low-editing efficiencies and mutational biasing, which greatly decrease the quality of the fitness data (i.e., due to the overabundance of wild type or a few over-represented members). As such, comprehensive DMS of essential genes using these approaches has remained elusive, especially in bacteria.

Bacterial genome-editing technologies have advanced greatly in the past decade. One technology is multiplexed automated genome engineering (MAGE) that is based on lambda Red-mediated recombination of single-stranded oligos for desired allelic exchange on the genome or “Recombineering” (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009)। The efficiency of introducing a single nucleotide change using recombineering is often very low and context-dependent (Sharan ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009)। Using MAGE, efficiency and throughput are improved by re-transforming the same large pool of oligos over repeated cycles (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009)। This technique has been successfully used for several outstanding synthetic biology and metabolic engineering applications (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009 Sandoval ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2012 Lajoie ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013b Raman ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2014 Amiram ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2015)। However, it may be difficult to apply MAGE for DMS of essential genes. Due to the repeated transformation cycles during library construction, the mutations that are deleterious or even neutral to the host would be lost (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009)। Repeated heat shock and electroporation during the recombineering cycles in the MAGE protocol (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009 ) would also add additional stress that would be detrimental to the diversity in essential genes. Additionally, in order to increase the efficiency of recombination in MAGE, significant modifications such as deletion of methyl-directed mismatch repair (MMR) and DNA primase (dnaG) are required, which change the native genetic context (Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2009 Sawitzke ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2011)। Deletion of mismatch repair systems increases the background mutation rate (Isaacs ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2011 ), which may also confound fitness estimates.

Genome-editing technologies developed using CRISPR/Cas9-mediated recombineering have helped address several challenges with MAGE. A chimeric guide RNA (gRNA) programs the Cas9 endonuclease to induce a DNA double-strand break (DSB) at any genomic target upstream of a 5′-NGG-3′ PAM sequence and complementary to the 20-bp spacer sequence in the gRNA (Jinek ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2012)। In several bacteria, including ਐਸਚੇਰੀਚੀਆ ਕੋਲੀ, the Cas9:gRNA-mediated DNA DSB induces cell death due to a lack of adequate DSB repair pathways (Jiang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013)। Therefore, Cas9:gRNA-induced DSBs can select for PAM substitutions introduced by recombineering (Cong ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013 Jiang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013)। Synonymous PAM-inactivating mutations (SPMs) can be coupled to other mutations in the same recombination template for precise genome manipulation with high efficiency using a single transformation step (Pyne ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2015 Reisch & Prather, 2015 Bassalo ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2016 Chung ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Wang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 ).

High-throughput genome editing with Cas9-mediated recombineering was achieved recently using CRISPR-enabled trackable genome engineering (CREATE) (Garst ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। Using CREATE, the DNA encoding the gRNA expressed under a constitutive promoter was covalently linked to the DNA repair template on 250-bp editing cassettes (Garst ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। Over 100,000 editing cassettes can be synthesized on microarray chips and subsequently cloned in high-throughput into cells with active Cas9 and lambda Red recombination to generate genome-wide mutation libraries. The editing cassettes on the plasmid also serve as the barcode to track the mutations before and after selection to assign fitness scores to each mutation (Garst ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। The technology has been used for directed evolution of ਈ. ਕੋਲੀ proteins, pathways, and strains (Shalem ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2014 Cobb ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2015 Cho ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Liang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Liu ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Lu ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Wu ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017a , b Zhu ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Bassalo ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 ). However, applying CREATE for DMS proved to be challenging. Anywhere between 10 and 60% of randomly chosen gRNA targeting different genomic loci have been shown not to induce Cas9:gRNA-induced cell death (Cui & Bikard, 2016 Zerbini ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। Consequently, due to variable selection, editing efficiency can vary between 0 and 100% across gRNAs (Garst ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017 Zerbini ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। Cells with gRNAs that fail to induce DSB-mediated cell death can grow significantly faster than cells with active gRNAs undergoing DSBs and editing (Jiang ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2015 Cui & Bikard, 2016 ). Consequently, in high-throughput non-DSB-inducing gRNAs, with low-editing efficiency, take over the population and reduce overall editing efficiency to only

1–4% (Bassalo ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 ). Several gRNAs also cause unintended mutations on the genome that are not encoded in the repair template (Cui & Bikard, 2016 Zerbini ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2017)। Consequently, cells with no edits and unintended mutations can be falsely tracked as beneficial mutations. Finally, each gRNA is coupled to a different synonymous PAM mutation (SPM) and synonymous mutations can lead to significant fitness effects, especially in essential genes (Lind ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2010 Agashe ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013 Lajoie ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2013a ). Because of these limitations, CREATE experiments have largely been limited to finding mutants with large fitness effects in the presence of strong selective pressures (Bassalo ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 Pines ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 ).

We posited that in order to target a single genomic locus, we could use a single pre-screened gRNA and synonymous PAM-inactivating mutations (SPM). In this study, we discuss the CRISPR/Cas9-mediated genomic error-prone editing (CREPE) technology. As opposed to other Cas9-mediated high-throughput technologies in ਈ. ਕੋਲੀ, in the CREPE protocol we use a single gRNA to integrate an error-prone PCR library of the target with the SPM on the genome (Fig 1). Recently, a similar technology, CASPER, was reported in yeast (Jakočiūnas ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2018 ). However, yeast has a significantly higher recombination efficiency than bacteria such as ਈ. ਕੋਲੀ. Recombination efficiency with linear dsDNA templates is very low in ਈ. ਕੋਲੀ (Murphy ਅਤੇ ਬਾਕੀ, 2000 ), and recombineering using dsDNA template with limited single nucleotide changes is poorly understood. Therefore, we varied the homology arm length and the Cas9 recombineering system to improve recombination and our understanding of recombination using a repair template with single nucleotide changes. We successfully developed a platform that efficiently generates unbiased and diverse genomic mutant libraries with > 80% editing efficiency for non-essential genes and > 55% efficiency for essential genes. Additionally, while CASPER was used for directed evolution, we adapted CREPE for use as a DMS platform to study essential ਈ. ਕੋਲੀ genes in their native genomic context. Using CREPE, we scored the fitness of naturally accessible mutations in the RNA polymerase beta subunit that confer resistance to rifampicin.


ਚਰਚਾ

We demonstrated previously that Red-mediated recombination with synthetic single-strand oligos is very efficient and independent of RecA in ਈ. ਕੋਲੀ. Only λ Beta appears to be required for this ssDNA recombination (Table 3) (9, 28, 36). Oligos that correspond to either of the two complementary DNA strands generate recombinants, but invariably one oligo recombines more efficiently than the other. By testing six markers in different regions of the chromosome, a pattern emerged (9). At each position, the most efficient of the two complementing oligos was the one corresponding to the lagging-strand DNA (i.e., the same sequence as the Okazaki fragments). We proposed that oligo-directed recombination occurred at the replication fork, and that the “lagging-strand oligo” is more easily annealed by Beta because of larger gaps present in the lagging strand (9, 29). Three points from the results presented here bear on our previous proposal that Beta-mediated recombination with ssDNA oligos occurs at the replication fork. First, we have demonstrated that four different oligos recombine more efficiently when each is targeted to the lagging strand than when targeted to the leading strand (Table 4). Second, we show that MMR can depress the appearance of recombinants by >100-fold (Table 2). The MMR functions MutS, MutL, MutH, UvrD helicase, and Dam methylase are required for mismatch repair at the replication fork (37). Third, when recombination occurs without bias due to MMR efficiencies, we see incredibly high recombination frequencies of 25%. It is difficult to come up with other mechanisms that generate a single-strand gap at a specific site in 25% of the cells during the time period of the experiment. We do not yet understand why 75% of the cells are resistant to recombination despite saturating levels of oligo. Among several possibilities, some cells may not be electrocompetent, may be in a state resistant to recombination, or may have the target sequestered from the oligo.

Although the lagging-strand oligos generate more recombinants than the leading-strand oligo, the leading-strand oligos are still very recombination proficient. Comparing four oligos (Table 4), lagging-strand recombinants are on average 30-fold more frequent than the leading strand. This may be explained by a proportionally different amount of ssDNA generated during replication on each side of the fork. By this logic, the gaps on the lagging-strand side would be 30 times greater than the gap on the leading-strand side. Of course, other factors could be responsible for this difference, because the type of replication and the factors present at the leading and lagging strands are different (38, 39).

One possible alternative we have explored elsewhere is that transcription generates single-strand regions and affects recombination bias (40). We found that gene transcription does not affect the strand bias observed for oligo-mediated recombination. Our results here strengthen that observation by showing that replication direction is critical to the strand bias.

There are eight possible mismatch pairs, and MutS protein has been shown to bind to each pair in vitro (41, 42). The four oligos used here generate four of those eight mismatches. Binding by MutS protein and repair by the MMR system have a similar hierarchical pattern for the eight mismatch pairs (42, 43). The pattern is G·T, A·C, A·A, G·G>T·T, T·C, A·G>C·C, where the C·C mismatch is very weakly bound and poorly corrected. Our studies support a similar pattern of repair efficiency with G·G>T·C>A·G>C·C. A 370-fold difference in repair exists between the well repaired G·G and the poorly repaired C·C mismatches (see lagging strand in Table 4). The same hierarchy and efficiency of correction were found for both the lagging and leading strands.

Because C·C mismatches are not recognized by MMR in other bacterial species (20, 44), this particular feature of oligo recombination might have the potential to create high recombination frequencies in other bacteria. For this reason and others, the ability to transfer the homologous recombination system to other bacterial species and even to eukaryotes would be very useful. Because ssDNA at the replication fork is bound by Ssb protein (45, 46), and Beta protein is important for the interaction between the oligo and the chromosome target, Beta may interact directly and specifically with Ssb (29). The λ Red system has been shown to work in ਸਾਲਮੋਨੇਲਾ ਟਾਈਫਿਮੂਰੀਅਮ (47–49), a species very closely related to ਈ. ਕੋਲੀ, and it may also work in other related Gram-negative bacteria. However, for more distantly related bacteria, it may be necessary to provide Beta-like functions from phage endogenous to those bacteria. Exo- and Beta-like proteins have already been identified in other bacterial phages and even eukaryotic viruses such as HSV-1 (50, 51).

Mismatch repair functions are known to prevent DNA exchange between related species by blocking recombination between homologous but divergent sequences (homeologous recombination) (24). A difference between the role of mismatch repair in homeologous recombination and in replication is that in the former, MutS and MutL appear to be required, whereas MutH and UvrD helicase have less importance (24, 25, 52). It is believed that MutS and MutL bind mismatches generated during homeologous exchanges, and the binding itself aborts further recombination without causing repair (53, 54).

Our results suggest the inhibition of oligo-mediated recombination by MMR functions is more analogous to the correction of DNA replication errors than to the role of MMR functions during homeologous recombination. MMR functions tested, including UvrD and MutH, appear to remove mismatches generated during oligo recombination and replication (Table 2). Also, unlike homeologous recombination, Feinstein and Low (55) found that during ਈ. ਕੋਲੀ conjugation between sequences with very few mismatches, the MMR system inhibited recombination and that, like oligo-mediated recombination, MutH and helicase are required. Perhaps, as we suggest for oligo recombination, the incoming strand transferred during normal conjugation is annealed at the replication fork. An alternative is that the recombination intermediates formed generate a new replication fork (39, 56, 57) and recruit the MMR complex. A recent discovery that ssDNA modification of murine embryonic stem cells is inhibited by MMR is consistent with our results and may indicate that in stem cells, the modification is also at the replication fork (58).

vivo ਵਿੱਚ recombination technologies we describe, due to their efficiency, accuracy, and simplicity, may replace classical in vitro genetic engineering techniques. The λ Red-mediated homologous recombination system, which we use as a genetic engineering tool, is particularly useful for modifying the genome of ਈ. ਕੋਲੀ, as well as cloned genome segments from other organisms (29, 59, 60). This study creates new opportunities for genome modification and vivo ਵਿੱਚ analyses of DNA mechanics. Using synthetic oligos, recombinants with the chromosome and episomes can occur at such high efficiencies that selection is not required. Oligos that create C·C mispairs are recombined into the DNA of cells at efficiencies approaching 25% among the survivors of electroporation. In other words, it might be possible to generate a C replacement of G anywhere in the chromosome at these high efficiencies if the change is not toxic to the cell. Recombination levels approaching 25% were also found for any oligo-generated mismatch in strains defective for the MMR functions tested. This advance in technology allows efficient genetic modifications and may permit nucleotide analogs and adducts to be incorporated directly into the chromosome for vivo ਵਿੱਚ biochemical studies.